Un spectrophotomètre est un des instruments scientifiques communément trouvés dans de nombreux laboratoires de recherche et industriels. Spectrophotomètres sont utilisés pour la recherche en physique , moléculaire biologie , la chimie et les laboratoires de biochimie. En règle générale, le nom fait référence à ultraviolet-visible (UV-Vis) Spectroscopie.
L'énergie de la lumière dépend de sa longueur d'onde , habituellement désigné comme ambda . Bien que le spectre électromagnétique s'étend sur une très large gamme de longueurs d'onde, la plupart des laboratoires ne peuvent mesurer une petite fraction d'entre eux. Mesures de spectroscopie UV-Vis entre 200 et 400 nanomètres (nm) de la lumière UVmesures et jusqu'à environ 750 nm dans le spectre visible .
Pour la spectroscopie UV-Vis, les échantillons sont généralement contenues et mesurés dans de petits récipients appelés cuvettes . Ceux-ci peuvent être en plastique si elles sont utilisées dans le spectre visible, mais doivent être quartz ou silice fondue s'il est utilisé pour les mesures UV. Il y a des machines qui peuvent utiliser des tubes à essai en verre.
La spectroscopie visible est souvent utilisé industriellement pour la colorimétrie . En utilisant cette méthode, les échantillons sont évalués à plusieurs longueurs d'onde de 400 à 700 nm, et leurs profils d'absorbance sont comparées à une norme. Cette technique est fréquemment utilisée par les fabricants de textiles et de l'encre. Les autres utilisateurs commerciaux de la spectroscopie UV-Vis comprennent des laboratoires médico-légaux et les imprimantes.
Dans la recherche biologique et chimique, les solutions sont souvent quantifiés en mesurant leur degré d'absorption de la lumière à une longueur d'onde particulière. Une valeur appelée le coefficient d'extinction est utilisé pour calculer la concentration du composé. Par exemple, les laboratoires de biologie moléculaire utilisent des spectrophotomètres pour mesurer les concentrations des échantillons d'ADN ou d'ARN. Ils ont parfois une machine de pointe appelée un spectrophotomètre ™ de NanoDrop qui utilise une fraction de la quantité d'échantillon par rapport à celle utilisée par les spectrophotomètres traditionnels.
Pour la quantification soit valide, l'échantillon doit obéir à la loi de Beer-Lambert. Il faut pour cela que l'absorbance est directement proportionnelle à la longueur du trajet de la cuve et l'absorption du composé. Il y a des tables de coefficients d'extinction disponibles pour beaucoup, mais pas tous, des composés.
Beaucoup spectrophotomètres chimiques et réactions enzymatiques changent de couleur au fil du temps, et sont très utiles pour mesurer ces changements. Par exemple, les enzymes de polyphénol oxydase qui causent des fruits au brun s'oxydent solutions de composés phénoliques, en changeant des solutions claires à ceux qui sont visiblement colorée. De telles réactions peuvent être analysés par mesure de l'augmentation de l'absorbance de la couleur change. Idéalement, le taux de variation sera linéaire, et on peut calculer les taux de ces données. Spectrophotomètre plus avancé aura un support de cuvette à température contrôlée pour effectuer les réactions à une température idéale précis pour l'enzyme.
Les laboratoires de biologie moléculaire et microbiologie utilisent fréquemment un spectrophotomètre pour mesurer la croissance des cultures de bactéries. expériences de clonage d'ADN sont souvent effectuées dans des bactéries, et les chercheurs ont besoin de mesurer le stade de croissance de la culture pour savoir quand effectuer certaines procédures. Ils mesurent l'absorbance, qui est connu comme la densité optique (OD), sur un spectrophotomètre. On peut dire de l'OD si les bactéries sont activement divisent ou s'ils commencent à mourir.
Les spectrophotomètres utilisent une source de lumière pour éclairer un tableau de longueurs d'onde à travers un monochromateur . Ce dispositif émet alors une bande étroite de la lumière, et le spectrophotomètre compare l'intensité de la lumière passant à travers l'échantillon à celui passant par un composé de référence. Par exemple, si un composé est dissous dans de l'éthanol, la référence serait l'éthanol. Le résultat est affiché en tant que le degré d'absorption de la différence entre eux. Cela indique l'absorption du composé de l'échantillon.
La raison à cela est que les deux absorbance UV et la lumière visible ont assez d'énergie pour exciter les produits chimiques à des niveaux plus élevés de l'énergie. Ce résultat d'excitation à une longueur d'onde plus élevée, qui est visible lorsque l'absorbance est représentée en fonction d'onde. Différentes molécules ou des composés inorganiques absorbent l'énergie à différentes longueurs d'onde. Ceux qui ont une absorption maximale dans le domaine visible sont considérés comme couleur par l'œil humain.
Les solutions de composés peuvent être clair, mais absorber dans la gamme UV. Ces composés ont généralement des doubles liaisons ou des anneaux aromatiques. Parfois, il y a un ou plusieurs pics détectables lorsque le degré d'absorption de longueur d'onde est portée en fonction. Si c'est le cas, cela peut aider à l'identification de certains composés en comparant la forme du complot contre que des parcelles de référence connus.
Il existe deux types de machines de spectrophotomètre UV-Vis, à faisceau unique et à double faisceau. Celles-ci diffèrent dans leur façon de mesurer l'intensité lumineuse entre la référence et l'échantillon de test. Machines à double faisceau mesurent le composé de référence et de test en même temps, alors que les machines à faisceau unique mesure avant et après le composé à tester est ajouté.
